Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на исследование влияния регуляторных последовательностей ДНК, а также локального состава хроматина на регуляцию экспрессии генов эукариот. Основным инструментом исследования являются репортёрные конструкции, которые помимо последовательности ДНК, кодирующей флуоресцентный белок eGFP, содержат тестируемые регуляторные последовательности ДНК – промоторы или мотивы, определяющие процессирование 3′-конца молекул пре-мРНК. Каждая отдельная репортёрная конструкция также характеризуется наличием уникальной последовательности ДНК длиной 18 п.н., называемой штрихкодом и располагающейся в 3′-нетранслируемой области. Помимо этого, конструкции с разными промоторными элементами содержат также и уникальные последовательности длиной 5 п.н., которые расположены непосредственно перед штрихкодом (эти последовательности называются промоторными индексами), а также концевые повторы транспозона piggyBac, которые фланкируют репортёрный ген. Для анализа влияния разных мотивов, присутствующих на некотором удалении после сигнала полиаденилирования (и, соответственно, преимущественно отсутствующих в молекулах мРНК) на уровень транскрипции гена-репортёра (так называемых, MPRA-экспериментов), смесь плазмид с разными тестируемыми последовательностями (мутациями) используется для кратковременной трансфекции культивируемых клеток. Из трансфицированных клеток выделяют РНК, на основе которой синтезируют кДНК и затем амплифицируют последовательности штрихкодов. При этом также готовится контрольный (нормировочный) образец, для чего последовательности штрихкодов амплифицируют со смеси плазмид, использованной для трансфекции клеток. Последующее высокопроизводительное секвенирование таких продуктов ПЦР позволяет определить влияние каждой конкретной мутации на уровень транскрипционной активности трансгена. Для анализа зависимости активности различных промоторных элементов от локального состава хроматина (так называемых, TRIP-экспериментов), смесь разных штрихкодированных репортёрных конструкций используется для ко-трансфекции культивируемых клеток вместе с плазмидой, кодирующей транспозазу piggyBac. В результате это приводит к интеграции репортёрных конструкций в случайно выбранные районы генома. Существенно, что при последующем культивировании трансфицированных клеток не производится какой-либо их селекции и дальнейший анализ выполняется на популяциях модифицированных клеток (так называемых TRIP-популяциях). Для этого, из клеток таких популяций выделяют РНК и геномную ДНК. Используя геномную ДНК и методику обратной ПЦР с последующим высокопроизводительным секвенированием, определяют локализацию штрихкодированных конструкций в геноме. Кроме того, как описано выше, оценивается транскрипционная активность каждой штрихкодированной конструкции. Нормировочный образец в этом случае готовится с использованием препарата геномной ДНК в качестве матрицы. Результаты наших исследований, выполненных на предыдущих этапах данного Проекта, показали, что нативная транспозаза piggyBac преимущественно встраивает репортёрные конструкции в активные типы хроматина, которые занимают лишь небольшую долю генома исследуемых культивируемых клеток дрозофилы. В результате, репрессированные типы хроматина характеризуются недопредставленностью в них инсерций (встроек) штрихкодированных трансгенов, что затрудняет исследование этих интересных типов хроматина. Кроме того, мы ранее обнаружили уникальное свойство у промотора гена PCNA дрозофилы – этот промотор, в отличие от всех остальных исследованных нами промоторов, демонстрирует достаточно высокий, и что более существенно – стабильный, уровень активности независимо от своего местоположения в геноме. Помимо этого, нами были ранее получены необходимые данные для определения зависимости паттернов индукции промоторов двух генов дрозофилы, Hsp70 и MtnA, от состава локального хроматина. В результате работ, выполненных в 2019 году, были получены следующие результаты. Во-первых, мы разработали и сконструировали серию химерных вариантов транспозазы piggyBac, в которых этот фермент «слит» с разными белками, характерными для репрессированных типов хроматина дрозофилы. Все эти химерные транспозазы демонстрируют при выборе мест интеграции репортёрных конструкций предпочтения к репрессированным типам хроматина, хотя некоторые из них при этом характеризуются общей сниженной активностью. Самыми удачными в плане дальнейшего использования в TRIP-экспериментах для насыщения репрессированных типов хроматина трансгенами оказались химерные транспозазы H1-L1-PB и HP1-L1-PB. Во-вторых, посредством анализа сайтов связывания транскрипционных факторов в последовательности промотора гена PCNA, а также путём использования конструкций с мутантными вариантами этого промотора в TRIP-экспериментах, мы установили, что наиболее вероятными факторами, ответственными за уникальные свойства этого промотора, скорее всего, являются белки DL и DREF. В-третьих, мы описали уникальные характеристики индукции промоторов генов Hsp70 и MtnA в зависимости от их локализации в геноме клеток дрозофилы. В частности, мы установили, что промотор гена Hsp70 может быть в значительной степени активирован тепловой обработкой клеток вне зависимости от его местоположения в геноме. Наконец, мы тщательно оценили эффект последовательностей самих штрихкодов на измерения транскрипционной активности генов-репортёров, выполняемые при анализе влияния разных мотивов, располагающихся на некотором удалении после сигнала полиаденилирования. В целом, полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, определяющих взаимодействия регуляторных последовательностей ДНК и состава локального окружения хроматина. Свойство промотора гена PCNA (а также потенциально промоторов других генов, предположительно регулируемых транскрипционными факторами DL и DREF) избегать влияния эффекта положения может быть использовано для совершенствования технологий трансгенеза, а также должно учитываться при анализе эволюционных изменений генома в целом.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на исследование влияния регуляторных последовательностей ДНК, а также локального состава хроматина на регуляцию экспрессии генов эукариот. Основным инструментом исследования являются репортёрные конструкции, которые помимо последовательности ДНК, кодирующей флуоресцентный белок eGFP, содержат тестируемые регуляторные последовательности ДНК – промоторы разных генов. При этом каждая отдельная репортёрная конструкция характеризуется наличием уникальной последовательности длиной 18 п.н., которая называется штрихкодом и располагается в 3′-нетранслируемой области. Помимо этого, конструкции также содержат последовательности длиной 5 п.н., которые являются уникальными для каждого из исследуемых промоторных элементов, располагаются непосредственно перед штрихкодом и называются промоторными индексами. На краях конструкций расположены обращённые повторы транспозона piggyBac, которые необходимы для их интеграции в случайные локусы генома. Для анализа зависимости активности различных промоторных элементов от локального состава хроматина (так называемых, TRIP-экспериментов), смесь разных штрихкодированных репортёрных конструкций используется для ко-трансфекции культивируемых клеток вместе с плазмидой, кодирующей транспозазу piggyBac. В результате это приводит к интеграции репортёрных конструкций в случайно выбранные районы генома. Существенно, что при последующем культивировании трансфицированных клеток не производится какой-либо их селекции и дальнейший анализ выполняется на популяциях модифицированных клеток (так называемых TRIP-популяциях). Для этого, из клеток таких популяций выделяют РНК и геномную ДНК. Используя геномную ДНК и методику обратной ПЦР с последующим высокопроизводительным секвенированием, определяют локализацию штрихкодированных конструкций в геноме. Кроме того, оценивается транскрипционная активность каждой штрихкодированной конструкции. Для этого на основе выделенной РНК синтезируют кДНК и затем амплифицируют последовательности штрихкодов. Нормировочный образец готовится также путём амплификации последовательностей штрихкодов, но с использованием препарата геномной ДНК в качестве матрицы. Далее осуществляется высокопроизводительное секвенирование всех продуктов ПЦР, подсчёт количеств каждого штрихкода в полученных прочтениях образцов экспрессии и нормировки и, наконец, расчёт нормированных значений экспрессии для каждого из штрихкодов. Результаты наших исследований, выполненных на предыдущих этапах данного проекта, показали, что нативная транспозаза piggyBac преимущественно встраивает репортёрные конструкции в активные типы хроматина, которые занимают лишь небольшую долю генома исследуемых культивируемых клеток Kc дрозофилы. В результате, репрессированные типы хроматина характеризуются недопредставленностью в них инсерций (встроек) штрихкодированных трансгенов, что затрудняет исследование этих интересных типов хроматина. Поэтому мы разработали и сконструировали серию химерных вариантов транспозазы piggyBac, в которых этот фермент «слит» с разными белками, характерными для репрессированных типов хроматина дрозофилы. Все эти химерные транспозазы продемонстрировали при выборе мест интеграции репортёрных конструкций предпочтения к репрессированным типам хроматина, хотя некоторые из них при этом характеризовались общей сниженной активностью. Самыми удачными в плане дальнейшего использования в TRIP-экспериментах для насыщения репрессированных типов хроматина трансгенами оказались химерные транспозазы H1-L1-PB и HP1-L1-PB. Кроме того, мы ранее обнаружили уникальное свойство у промотора гена PCNA дрозофилы. Этот промотор, в отличие от всех остальных исследованных нами промоторов, характеризовался достаточно высоким, и что более существенно – стабильным, уровнем активности независимо от своего местоположения в геноме. Посредством анализа сайтов связывания транскрипционных факторов в последовательности промотора гена PCNA, а также путём использования конструкций с мутантными вариантами этого промотора в TRIP-экспериментах, мы установили, что наиболее вероятными факторами, ответственными за уникальные свойства этого промотора являются белки Dl, E2f1 и Dref. В 2020 году были получены следующие результаты. Во-первых, мы выяснили, что нокдаун генов dl, E2f1 и Dref в культивируемых клетках Kc дрозофилы посредством РНК-интерференции характеризуется низкой эффективностью, что, вероятно, вызвано или очень долгим временем жизни транскриптов этих генов (а также, возможно, и кодируемых ими белковых продуктов) и/или существованием механизмов отрицательной обратной связи, которые обеспечивают повышение транскрипционной активности этих генов в ответ на снижение количества соответствующих транскриптов. Во-вторых, результаты TRIP-экспериментов, выполненных в культивируемых клетках Kc с использованием репортёрных конструкций с промотором гена PolA1, который также как и промотор гена PCNA регулируется транскрипционными факторами Dref и E2f1, продемонстрировали, что этот промотор также характеризуется стабильной активностью, практически независимой от его местоположения в геноме. Это свидетельствует в поддержку гипотезы об участии транскрипционных факторов Dref и E2f1 в феномене блокирования эффекта положения. В-третьих, результаты TRIP-экспериментов, также выполненных в культивируемых клетках Kc, но с использованием репортёрных конструкций с промоторами генов Nipped-B, sxc, slbo, bcd, rhi и sna, которые в норме локализуются в репрессированных типах хроматина, в целом не выявили значительной активации этих промоторов при их перемещении как в активные, так и в другие репрессированные типы хроматина. В-четвёртых, были подробно исследованы предпочтения химерных транспозаз, созданных нами в 2019 году, в плане выбора ими участков генома для инсерции трансгенов. В частности, было установлено, что транспозазы Eff-L1-PB, HP1-L1-PB и HP6-L1-PB демонстрируют стабильные свойства на уровне фрагментов генома размером 500 т.п.н. в клетках Kc и S2. Кроме того, химерные транспозазы Pc-L1-PB, H1-L1-PB и Eff-L1-PB предпочитают встраивать трансгены в низко экспрессирующиеся гены. В целом, полученные результаты позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов, определяющих взаимодействия регуляторных последовательностей ДНК и состава локального окружения хроматина. Свойство промоторов генов PCNA и PolA1 избегать влияния эффекта положения может быть использовано для совершенствования технологий трансгенеза, а также должно учитываться при анализе эволюционных изменений генома в целом. Разработанные нами химерные транспозазы, обладающие уникальными свойствами, могут быть немедленно использованы в экспериментальной работе на плодовой мушке дрозофиле (и, возможно, других насекомых), касающейся трансгенеза «труднодоступных» и малоактивных районов генома.